Главной святыней Ахтырского монастыря была икона Божией Матери «Всех скорбящих Радосте»
Точных данных о том, когда она появилась в монастыре, нет.
По легенде, чудотворная Ахтырская икона была явлена 2 июля 1739 г. в г. Ахтырка Харьковской губернии. Образ, от которого исходило сияние, был обретён священником Покровского храма Василием Даниловым в траве во время сенокоса. Икону перенесли в его дом.
Через три года, в праздник Покрова, священник вошел в комнату и был поражен необычайным светом, исходившим от иконы. Это стало часто повторяться, но священник благоговейно молился и никому об этом не говорил. Однажды во сне он увидел Богоматерь, которая велела очистить от пыли и омыть чистою водою обретенную им икону. Священник, пробудившись ото сна, тотчас же исполнил указание, а воду, в которой омыл икону, собрал в сосуд, чтобы поутру вылить в реку. Снова заснув, он увидел во сне, как идёт к реке, несёт сосуд с водой, которой омыл икону, но по пути слышит голос Богоматери: «Возвратись домой и храни эту воду, она будет исцелять всех страждущих лихорадкою». У священника была дочь, давно болевшая лихорадкой. Проснувшись, он дал ей выпить этой воды, и дочь выздоровела.
Тогда священник поручил иконописцу Иоанну закрасить повреждения на иконе. Зная о чудесных исцелениях, иконописец омыл икону водою и напоил ею сына, страдавшего от лихорадки, и он тоже выздоровел. Готовясь к началу работы, ночью иконописец услышал исходящий от иконы голос: «Встань! Наступило время отнести икону туда, откуда ты ее взял. Исправить ее ты не можешь». Иконописец до утра молился перед иконой, а рано утром отнес ее отцу Василию, который установил её в Покровском храме, чтобы страдавшие лихорадкой люди молились этой иконе и во множестве получали чудесное исцеление.
В 1751 г. Святейший синод, закончив продолжительное «следствие о чудесах святой иконы», постановил почитать ее как чудотворную. В 1768 г. на пожертвование императрицы Елизаветы на месте явления иконы был построен каменный Покровский собор, в котором икона находилась вплоть до её похищения в 1903 г. во время отправления на реставрацию в Санкт-Петербург.
Позже святая икона обнаружилась в Харбине, куда она попала непонятным образом. В 1950-х гг. икону вывезли в Бразилию, а затем — в Сан-Франциско, где передали Комитету русской православной молодёжи как благословение. В настоящее время Ахтырская икона находится в ведении архиепископа Иллариона Сиднейского.
С Ахтырской иконы, которая почитается как целительница от многих болезней, был сделан ряд списков, распространенных в основном на юге России, в Харьковской епархии. Чтимый список XVIII-XIX вв. находится в Москве. Ахтырская икона, именуемая «Самарской», — главная святыня Самарского Пустынно-Николаевского мужского монастыря.
В 1975 г. появились сведения о том, что утраченная Ахтырская икона находится в Сан-Франциско, и в 1995 г. митрополит Харьковский Никодим (Руснак) привез список с иконы и передал его в Ахтырский Покровский собор. В связи с этим событием был возобновлён крестный ход на третий день после Дня Святой Троицы со списком иконы на место Ахтырского во имя Святой Троицы монастыря. Ход этот совершался с 1844 г. в субботу Пятидесятницы, а обратно икона переносилась в праздник Всех святых. 15 июня 1999 г. в Ахтырке прошли торжества по случаю 260-летия явления чудотворной Ахтырской иконы.
В ее честь были освящены храм в с. Чернетове Брянской области, Ахтырский женский монастырь в с. Гусевка Волгоградской области, храм в с. Ахтырка Сергиево-Посадского района Московской области, часовня при республиканской больнице в Петрозаводске.